MC38- hPD-L1是将MC38细胞进行改造， hPD-L1替代mPD-L1。首先加入Human PDL1抗体与MC38- hPD-L1细胞共孵育，再加入荧光标记的二抗。通过流式细胞术检测受试抗体与细胞的特异性结合。

ADCC

ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity): 抗体Fc与人NK细胞、巨噬细胞或单核细胞表面的FcγRIIIa结合，诱导效应细胞分泌穿孔素和颗粒酶来对靶细胞进行杀伤。

ADCC-FACS Aassay

本实验以人PBMCs作为效应细胞。以高浓度CFSE标记的Jurkat- hCTLA4细胞为靶细胞，以低浓度CFSE标记的Jurkat WT细胞为对照细胞。效应细胞、靶细胞和对照细胞在不同浓度的抗人CTLA-4抗体存在下孵育18h。

Cytotoxicity %＝[1-（对照孔比率/实验孔比率）]× 100；

比率=（CFSE_low细胞数/ CFSE_high细胞数）

ADCC-LDH Assay

本实验以人PBMCs作为效应细胞(E)，以Raji细胞作为靶细胞(T)， E:T=10:1，加入不同浓度的CD20 IgG1抗体，孵育过夜后，LDH法检测杀伤效应。

ADCC-Incucyte Assay

以NK 细胞作为效应细胞(E)，以CFSE 标记的Raji细胞作为靶细胞(T)， E:T=5:1，加入不同浓度的CD20 IgG1抗体，培养基中加入低浓度的PI，置于37℃、5%CO₂ 条件下，Incucyte 每隔4hr进行拍照。4hr时间点，分析每孔CFSE+活细胞数，比较不同浓度CD20 抗体的ADCC效应。

Cytotoxicity %=[1-(实验孔活细胞数)/(对照组活细胞数)]× 100

ADCP

ADCP (Antibody-dependent cell-mediated phagocytosis): 抗体Fc与人巨噬细胞/单核细胞表面的FcγRIIa结合，诱导巨噬细胞对靶细胞的吞噬作用。

ADCP-FACS Assay

使用Far Red染料标记巨噬细胞（E）， CFSE染料标记Raji细胞（T）。E:T=1:5，加入不同浓度的CD20 IgG1抗体，孵育4hr，流式检测巨噬细胞的吞噬效应。

Phagocytic Index (PI) =(number of ingested macrophages)/(number of total Macrophages)×100%

CDC

CDC (Complement –dependent cytotoxicity ): 抗体的Fab与靶细胞结合后，会将抗体铰链区的补体结合位点暴露出来，之后，补体的C1q与之结合，接着C2-C9就被激活形成攻膜复合物（MAC），在靶细胞表面打孔，对靶细胞发挥裂解效应。

CDC-LDH Assay

CD20 IgG1抗体介导的CDC实验。 在含有补体的情况下，将Raji细胞与不同浓度的CD20 IgG1抗体混合，并孵育2h。  LDH法检测抗体细胞毒作用。

Cytotoxicity %=（实验孔LDH检测值-自发释放孔LDH检测值）/（靶细胞最大LDH释放-自发释放孔LDH检测值）× 100

CDC-Incucyte Assay

在含有补体的情况下，将Raji细胞与不同浓度的CD20 IgG1抗体混合，培养基中加入低浓度的PI，置于37℃、5%CO₂ 条件下，Incucyte  2hr进行拍照。

Cytotoxicity %=[1-(实验孔活细胞数)/(对照组活细胞数)]× 100

a. 效应细胞激活

混合淋巴细胞反应 MLR

将人CD4+T细胞和异体树突细胞以10:1的比例于96孔圆底培养板中混合，加入不同浓度的nivolumab（in house），孵育120小时后ELISA测定释放IFN-γ含量。结果表明，nivolumab（in house）在混合淋巴细胞反应（MLR）中剂量依赖性地增强了IFN-γ的产生。

T细胞激活实验

人PBMC与SEB（10 ng / mL）共孵育，加入不同浓度的Ipilimumab或同型对照抗体，孵育48h后， 通过ELISA方法检测IL-2的释放。 结果表明，ipilimumab剂量依赖性地增强SEB刺激PBMC产生IL-2。

b. 酶活性阻断

使用MDA-MB-231细胞作为靶细胞，加入不同浓度的CD73抗体在37℃孵育30min；再加入 AMP孵育3h；最后加入ATP和荧光素酶 +底物， 检测荧光值。

随着CD73抗体浓度的升高，CD73酶活性被抑制，荧光值下降。

c. 靶细胞增殖抑制

细胞增殖-CTG Assay

BT-474细胞加入不同浓度的Trastuzumab（in house）共孵育，72小时后CTG法检测细胞增殖。结果表明，Trastuzumab（in house）剂量依赖性地抑制BT-474细胞增殖。

d. 抗体内吞检测

使用pH敏感的染料标记抗体，细胞内吞抗体后，抗体进入溶酶体。在溶酶体较低的pH条件下，染料发出较强的荧光。使用流式可检测细胞对抗体的内吞。

MC38-hCLDN18.2细胞加入pH敏感的染料标记的CLDN18.2抗体， 37℃、5%CO₂ 条件培养24hr后，流式检测抗体内吞。随抗体浓度的升高，内吞作用逐渐增强。