哮喘小鼠（C57BL/6）模型的构建及验证

Experimental Animals：C57BL/6, BALB/c, 5-6 weeks old, female

Modeling reagent：OVA + Al(OH)₃

Modeling method：Sensitization phase: OVA + Al(OH)₃ was injected intraperitoneally on days 0, 7, and 14;

                                challenge phase: mice were nebulized with 2% OVA for 30 min daily on days 21 – 25.

哮喘小鼠模型肺泡灌洗液（BALF）中免疫细胞的数量

使用OVA在野生型C57BL/6小鼠中诱导哮喘模型。（A）BALF 中CD45+细胞的数量；（B）BALF 中嗜酸性粒细胞的数量；（C）嗜酸性粒细胞占CD45+细胞的比例。结果显示：经OVA致敏和激发后，G2造模组小鼠的白细胞数量与G1未造模组相比显著增加，其中嗜酸性粒细胞数量及比例都有显著增加。

哮喘小鼠模型血清中IgE水平

哮喘小鼠模型血清中IgE水平的检测。实验终点取血清，使用ELISA检测OVA特异性的IgE和血清总IgE的浓度。（A）血清中OVA 特异性IgE的浓度。（B）血清中总IgE的浓度。结果显示：G2造模组与G1未造模组相比血清中OVA特异性IgE和总IgE的浓度显著性升高。

哮喘小鼠模型H&E染色病理分析

哮喘小鼠模型肺部H&E染色分析。结果显示：与G1未造模组相比，G2造模组动物肺脏镜下均表现出血管及支气管周围混合炎细胞浸润(b)和部分支气管中黏液(a)形成的哮喘相关病理性改变。以上结果证明OVA能成功诱导野生型C57BL/6小鼠建立哮喘模型。

哮喘小鼠模型（BALB/c）的构建并用于评价皮质类固醇类免疫抑制剂地塞米松的药效

使用野生型BALB/c小鼠构建哮喘模型，在第0天、7天、14天，腹腔注射OVA和Al(OH)₃致敏小鼠；21-25天雾化吸入卵清蛋白后激发，20-25天腹腔注射地塞米松，共给药6次。

哮喘小鼠模型肺泡灌洗液（BALF）中免疫细胞的数量

使用OVA在野生型BALB/c小鼠中诱导哮喘模型。（A）BALF 中CD45+细胞的数量；（B）BALF 中嗜酸性粒细胞的数量；（C）嗜酸性粒细胞占CD45+细胞的比例。结果显示：经OVA致敏和激发后，G2造模组小鼠的白细胞数量与G1未造模组相比显著增加，其嗜酸性粒细胞的数量与比例都有显著增加，提示造模成功。给予不同浓度的地塞米松（Dex）后，其CD45阳性细胞和嗜酸性粒细胞与G2造模组相比显著性降低。

哮喘小鼠模型血清中的IgE水平

哮喘小鼠模型血清中IgE水平的检测。实验终点取血清，使用ELISA检测OVA特异性IgE和总IgE的浓度。（A）血清中OVA 特异性IgE的浓度。（B）血清中总IgE的浓度。结果显示：G2造模组与G1未造模组相比血清中OVA特异性IgE和总IgE水平显著性增加，提示造模成功。给予不同浓度地塞米松（Dex）后其特异性IgE和总IgE水平与G2造模组相比显著性降低，且缓解程度呈现一定的剂量依赖性。

H&E染色病理分析

哮喘小鼠模型肺部H&E染色分析。结果显示G1未造模组肺部气道未见炎症反应。G2造模组的血管及支气管周围炎症显著增加，粘液分泌水平增加，提示造模成功。G3-G6给药组给予不同浓度地塞米松后，小鼠炎症浸润和黏液分泌减少。以上结果证明OVA诱导的小鼠哮喘模型能成功用于验证皮质类固醇类免疫抑制剂的药效。

哮喘小鼠模型（B-hIL4/hIL4RA）的构建并用于评价抗人IL4RA抗体药物dupilumab的药效

使用B-hIL4/hIL4RA小鼠构建哮喘模型，在第0天、7天、14天，腹腔注射OVA和Al(OH)₃致敏小鼠；21-25天雾化吸入OVA后激发，在第20和23天腹腔注射IL4RA 抗体药物dupilumab（内部合成）。

哮喘小鼠模型肺泡灌洗液（BALF）中免疫细胞的数量

使用OVA在B-hIL4/hIL4RA小鼠中诱导哮喘模型。（A）BALF 中CD45+细胞的数量。（B）BALF 中嗜酸性粒细胞的数量。（C）嗜酸性粒细胞占CD45+细胞的比例。结果显示：经OVA致敏和激发后，G2造模组小鼠的白细胞浸润与G1未造模组相比显著增加，其嗜酸性粒细胞含量显著增加，提示造模成功。给予dupilumab (内部合成) 后，其CD45+细胞和嗜酸性粒细胞的数量与G2造模组相比显著降低。

哮喘小鼠模型血清中IgE水平

哮喘小鼠模型血清中IgE水平的检测。实验终点取血清，使用ELISA检测OVA特异性IgE和总IgE水平。（A）血清中OVA 特异性IgE水平。（B）血清中总IgE水平。结果显示：G2造模组与G1未造模组相比OVA特异性IgE和总IgE水平显著增加，提示造模成功。给予dupilumab (内部合成) 药物后其特异性IgE和总IgE水平与G2造模组相比显著性降低。

H&E染色病理分析

哮喘小鼠模型肺部H&E染色分析。结果显示G1未造模组肺部气道未见炎症反应。G2造模组的血管及支气管周围炎症(b)显著增加，粘液(a)分泌水平增加，提示造模成功。G3给药组显示经dupilumab（内部合成）治疗的小鼠炎症浸润和粘液分泌减少。以上结果证明OVA能成功在B-hIL4/hIL4RA小鼠中建立哮喘模型用于药效评价。

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参考文献：

1. Gandhi, N.A. et al. Targeting key proximal drivers of type 2 inflammation in disease. Nat Rev Drug Discov 15, 35-50 (2016).

2. Pelaia, G., Vatrella, A. & Maselli, R. The potential of biologics for the treatment of asthma. Nat Rev Drug Discov 11, 958-972 (2012).

实验动物:C57BL/6, BALB/c, 5-6周龄，雌性 

建模试剂:50μg HDM in 50μl PBS (intranasally, i.n.)

Criteria of Asthma Mouse Model Establishment

哮喘小鼠模型肺泡灌洗液（BALF）中免疫细胞的数量

哮喘小鼠模型血清中IgE水平

与对照组相比，HDM诱导的小鼠血清中IgE水平升高。实验终点取血清，ELISA法测定总IgE浓度。

H&E染色病理分析

哮喘小鼠肺部H&E染色分析。与G1组相比，HDM处理后的G2模型动物出现哮喘相关病变，部分支气管血管和支气管周围混合炎性细胞浸润(b)、黏液形成(a)。以上结果表明，HDM可成功诱导野生型C57BL/6小鼠哮喘。

Dupilumab(抗人IL4RA抗体药物)在人源化B-hIL4/hIL4RA哮喘小鼠中的药效评估

采用HDM法建立B-hIL4/hIL4RA小鼠哮喘模型。(A) BALF中CD45 +细胞的数量。(B) BALF中嗜酸性粒细胞的数量。(C)嗜酸性粒细胞占CD45 +细胞的比例。结果显示，经HDM致敏和激发后，G4模型组小鼠白细胞浸润较G3对照组明显增加，嗜酸性粒细胞含量明显增加，提示模型建立成功。给药25mg/kg dupilumab(内部合成)后，CD45 +细胞和嗜酸性粒细胞数量明显低于G3模型组。

哮喘小鼠模型血清中IgE水平

哮喘小鼠血清中IgE水平的检测。实验终点取血清，采用ELISA法测定血清总IgE水平。结果显示，与G3对照组相比，G4模型组大鼠总IgE水平明显升高，表明造模成功。与G5模型组相比，给药dupilumab(内部合成)后总IgE水平显著降低。

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参考文献

1. Gandhi, N.A. et al. Targeting key proximal drivers of type 2 inflammation in disease. Nat Rev Drug Discov 15, 35-50 (2016).

2. Audrey Le Floc’h, N.A. et al. Dual blockade of IL-4 and IL-13 with dupilumab, an IL-4Rα antibody, is required to broadly inhibit type 2 inflammation. Allergy, 75(5), 1188-1204(2020)

哮喘小鼠模型建立

Experimental Animal：C57BL/6, Balb/c, B-hIL33/hST2 mice

Modeling reagent：ALT  (Alternaria )

Modeling method：Sensitization—1-5 days

                               Challenge—19-26days

基于C57BL/6小鼠的ALT诱导的哮喘小鼠模型的BALF中免疫细胞的定量和血清中总IgE水平。（A） 在用ALT致敏和激发后，CD45+细胞群中CD45+的细胞数、嗜酸细胞和嗜酸细胞比例。（B）在实验终点采集血清，并使用ELISA测量总IgE的浓度。数值表示为平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01。

哮喘小鼠模型肺组织组织学评价

支气管哮喘小鼠肺组织H&E染色。ALT诱导的哮喘模型动物出现哮喘相关的病理改变，表现为血管和支气管周围混合性炎症细胞浸润，部分支气管出现黏液形成。ALT治疗后细胞评分、血管和支气管周围嗜酸性粒细胞浸润增加。

参考文献

1. Michael C Yee. Et al. Protease-activated receptor-2 signaling through β-arrestin-2 mediates Alternaria alkaline serine protease- induced airway inflammation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 315(6):L1042-L1057 (2018).

2. Robert J Snelgrove. et al. Alternaria-derived serine protease activity drives IL-33-mediated asthma exacerbations. J Allergy Clin Immunol. 134(3):583-592.e6 (2014).

3. Gandhi, N.A. et al. Targeting key proximal drivers of type 2 inflammation in disease. Nat Rev Drug Discov 15, 35-50 (2016).

4. Pelaia, G., Vatrella, A. & Maselli, R. The potential of biologics for the treatment of asthma. Nat Rev Drug Discov 11, 958-972 (2012).

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