ELISA

Electrochemiluminescence (ECL)

人源（化）单克隆抗体小鼠血药浓度分析

药物浓度检测是药代动力学研究的重要指标，开发可以准确稳定地检测血液样本中药物浓度的检测方法非常重要，目前应用最为广泛的抗体药物浓度检测方法是ELISA法，通过使用不同种类的ELISA方法可以对单抗，双抗浓度进行分析。

基于双抗体夹心法，使用抗人的抗体对血清中的人源化抗体进行捕获，再加入标记有HRP的可特异性结合人源化抗体的Fcγ fragment的抗体作为检测抗体，检测血清中药物浓度

特点：

基于双抗夹心法ELISA的药物浓度检测方法，可以检测IgG1，IgG2，IgG4亚型的单克隆抗体和具有完整抗体结构的融合蛋白和双特异性抗体。

有固定的实验条件，可以快速进行样本检测，可支持方法学验证。

主要检测血清中人源化抗体的总量，包括已经和可溶性靶点结合的抗体。

非特异性结合抗体药物，不能在联合给药情况下分析目标抗体浓度。

本方法仅限于检测非人动物样本中的药物浓度检测。

根据药物靶点开发方法，捕获试剂为人源化抗体的靶蛋白，可以特异性与抗体的CDR区结合。再加入标记有HRP的可特异性结合人源化抗体的Fcγ fragment的抗体作为检测抗体，检测血清中药物浓度

特点：

根据抗体靶点开发的特异性检测方法，针对受试品具有高度特异性，可以在联合用药情况下检测目标抗体。

一般根据需求开发方法或进行方法转移，可支持方法学验证。

严格意义上讲，此类方法主要检测血清中游离的人源化抗体量，无法检测已经与靶点结合的抗体。

人双特异性抗体小鼠血药浓度分析

根据药物靶点开发方法，用于检测血清中具有完整结构的双特异性抗体，捕获试剂为人源化抗体的靶蛋白，可以特异性与抗体的CDR区结合，加入双特异性抗体另一特异性靶点蛋白（带有Biotin或His标记）完成整个检测体系的建立。加入Streptavidin-HRP或Anti-His Antibody-HRP产生检测信号

特点：

根据抗体靶点开发的特异性检测方法，针对受试品具有高度特异性，可以检测血清中具有完整结构的双抗，可以用于临床前申报方法。

ELISA-交替采血策略(抗体T_1/2为5~10天)

ECL微采样策略(抗体T_1/2为5~10天)

数据分析

PK研究的研究设计

• 建议采用血清进行PK检测。
• 肝素钠有时会影响结果。血浆采集建议使用EDTA.2Na和EDTA.2K等抗凝血剂。
• 提出符合临床实际的给药方法。
• 建议静脉给药。
• 推荐9-10周龄小鼠。

抽样方法的比较

不同采样方法检测结果的比较

数据表明，两种采样方法的实验结果没有明显差异。

表1.抗体在人、猴、B-hFcRn和野生型小鼠体内的半衰期(天)

¹贝伐单抗样本数量相对较少。

图1.人与猴(A)、B- hfcrn小鼠(B)的半衰期相关性(仅包括人IgG1单抗)

*更多的抗体正在接受测试。

B-hCD40小鼠可用于抗人CD40抗体PK / PD /功效检测

受体占用分析

体内药效学评价

抗人TFR1 HCAb穿透血脑屏障

抗人TFR1 HCAb Ab.16穿透B-hTFR1小鼠的血脑屏障，通过定量脑实质hIgG和免疫荧光验证。

CD40-PD-1双特异性抗体

B-hPD1/hCD40 mice

CD40-PD-1双特异性抗体在B - hPD-1/hCD40小鼠中的PK检测

HER2×TROP2 BsADC在NCI-H1975异种移植模型中的药动学分析

单次给药3mg /kg HER2×TROP2 BsADC后，发现有效载荷MMAE在肿瘤中积累，但在血浆中含量较低。这表明HER2×TROP2 BsADC已经达到了MMAE的有效肿瘤靶向递送，并且可能具有更好的抗肿瘤活性。

在使用生物药进行治疗的过程中，一些生物体会产生免疫反应，其中最显著的是抗药物抗体(ADA)。免疫原性是一种特殊物质引起免疫反应的能力。ADA-mAb免疫复合物的形成是单克隆抗体的额外清除途径，对体内单克隆抗体的治疗和消除具有重要影响。

常用的ADA检测方法利用ADA与药物特异性结合的特点，检测小鼠体内产生的抗药物抗体(本质上是小鼠抗人IgG)。

研究案例-小鼠血清中ADA的检测

计算生理盐水组和给药前样本的信噪比值(SNR=单样本信号值/池串联信号值)。排除异常值后，利用剩余样本的信噪比计算筛选阈值1.24。将所有样本的信噪比值与筛选阈值进行比较，高于筛选阈值的记录为正“+”，低于筛选阈值的记录为“-”。NA:由于小鼠死亡无法取样。

参考资料

1. Guidelines for the survival bleeding of mice and rats.(2010).

2. Diehl K. H. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J.Appl.Toxicol.21,15-23(2001).

3. Janet H, et al. Methods of Blood Collection in the Mouse.Lab Animal.29 (10):47-53.(2010).

4. Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry （FDA 2018）