常规免疫组化（IHC）是组织病理学中广泛使用的诊断技术。然而，这种技术存在许多局限性，包括观察者之间的高变异性和每个组织切片仅能标记一个标记物的能力。为规避这些限制而出现了各种高度多重染色技术，允许在单个组织切片上同时检测多个标记物，并全面研究细胞组成、细胞功能和细胞间相互作用。在这些技术中，多重免疫组化技术（mIHC）尤其有代表性。mIHC 提供高通量多重染色和标准化定量分析，不仅可以对组织细胞原位靶标类别、组分、表达量等信息进行分析，还可以研究各靶标相互作用的空间位置信息，可实现高度可重复、高效且具有成本效益的组织研究。该技术在转化研究和临床实践方面具有直接的潜力，特别是在癌症免疫治疗时代。

TSA技术介绍

TSA技术原理

TSA即酪氨酸信号放大 (Tyramide dignal amplification) 技术，是mIHC的代表性技术，是一类利用辣根过氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP) 对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。该方法主要原理是酪胺(Tyramide)的过氧化物酶反应(酪胺盐在 HRP 催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)共价结合，该方法可在一张组织切片上实现6-8种靶标的标记，通过荧光图像分析挖掘组织微环境中的复杂信息，如定量分析、共表达确定细胞分型、空间关系分析等等。

TSA技术优势

与传统免疫荧光相比，TSA多重染色技术在能够完整显现组织原位形态信息的同时，还具有如下的特点和优势：

• 首先是信号放大，TSA技术可以用于检测传统免疫荧光无法检出的低丰度靶标。基于酪酰胺的信号放大技术能够提供极强的灵敏度、检测极微量的目的抗原。
• 传统免疫荧光受传统染色成像的限制，靶标一般少于 3 个，无法完整分析组分信息。而多重荧光免疫组化可实现6-8多因子共定位，可以获取更多的生物信息，且样本需求量较少。
• 不受一抗种属的限制由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，同源异源都一个步骤，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。
• 再次是能大大节约一抗，因为是信号放大技术，为避免背景荧光过强，所以一抗稀释比是常规建议稀释浓度的5-10倍。

TSA操作步骤

TSA技术的染色流程与经典免疫组织化学染色步骤相近，值得注意的是，依次加入一抗的过程中，额外增加了修复热处理洗脱步骤，该步骤可以将以非共价键结合在抗原上的抗体去除，但是仍然保留以共价键结合在抗原表面的TSA荧光信号，从而实现无抗体干扰的抗原直接标记，再经过多轮染色循环实现多色标记，无需考虑多种抗体之间的非特异反应。直至全部标记完成，复染DAPI后封片观察即可

TSA实验注意事项

TSA多重循环染色实验的panel设计和优化对于获得可重复的、可靠的、高质量的数据是非常关键的。为此，Panel设计和优化时需要考虑多方面影响：

• 操作过程中避免切片干燥，并注意避光；
• 修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定；
• 靶点先后顺序的选择，不能长时间修复的抗原，安排到第一轮，需长时间修复的则安排到最后一轮；
• 一抗的选择（尽量选可用于IHC-P的单克隆抗体）、特异性验证以及抗体最佳稀释度；
• 平衡待检样品中靶点峰度和各通道信号强度，尽量做到：寡靶配强光，众靶配弱光；
• 染色顺序：通道串开，跳着染，避免因相邻光谱的TSA荧光染料信号没有平衡好造成的光谱遗漏效应，即信号串色；
• 占位效应：“先低后高”、“先少后多” 和适度原则，先染丰度低、表达范围少的靶点，后染丰度高、表达范围广的靶点；结果清晰可见即可，不追求晃瞎眼的染色效果；
• 低丰度靶点选择较短波长荧光，且先染；高丰度靶点选择较长波长荧光，后染。

TSA检测应用

多重免疫组化（荧光）染色

可以直观的展示两个或两个以上标记物在同一张组织切片上的共表达情况

B-hCD33mice

肿瘤免疫微环境分析

对肿瘤免疫细胞亚群进行标记和定量，揭示肿瘤免疫微环境的组成和功能，有助于了解肿瘤与免疫系统的相互作用。

微环境中不同类型细胞间的空间分布关系

分析肿瘤组织中不同细胞类型及其分子标记物的空间分布特征，揭示肿瘤微环境中各种细胞群体之间的相互作用和调节机制。

助力发文章&国自然申请

利用多重免疫荧光染色实验，轻轻松松发4-10分的论文；只有你有idea，百奥赛图超全的实验技术+严谨的科学态度，让你的paper分分钟搞定！

Multiplex immunohistochemistry defines the tumor immune microenvironment and immunotherapeutic outcome in CLDN18.2-positive gastric cancer

杂志：Cell

影响因子：IF-6.782

发表时间：2022年07月

Clinical Impact of Immune Cells and Their Spatial Interactions in Diffuse Large B-Cell Lymphoma Microenvironment.

杂志：Clin Cancer Res

影响因子：IF-8.911

发表时间：2022年2月

多重免疫组化（荧光）染色在国自然申请过程中，比如肿瘤免疫研究、干细胞分化的标志物鉴定等过程中运用该技术，都会是一个很好的加分项，不仅实验成图好看，最重要的也是能将分子间复杂的互作以及定位信息做到了原位反映。

百奥动物TSA服务

TSA服务流程

百奥动物可以为客户提供7色6标或7色以内的TSA检测服务，服务流程可根据每个项目不同分三部分完成：

定制化服务：

根据不同的检测需求，设计专属的检测方案；下图为常用的多色Panel展示；此外我们还拥有200+抗体经过验证可用于TSA实验，或根据需求购置抗体，满足不同的实验目的。

TSA实验设备

百奥动物公司配备有徕卡全套的切片制备仪器、Bond全自动染色仪和多色荧光扫描仪，助力多重免疫组化的技术服务。

TSA结果成像

Akoya Vectra Polaris全组织切片多色荧光定量分析仪是新一代的组织切片成像分析系统，将光谱成像和切片全景扫描功能完美融合：

• 兼顾明场/ 荧光两种成像模式；
• 光谱拆分技术有效识别多重信号（多达9色荧光），检测波长范围440nm ─780nm；
• 高速自动化全组织片扫描成像（10X—40X）荧光：仅需6分钟完成整张组织切片7色荧光扫描；
• 高敏对焦技术，提升扫描稳定性；
• 荧光脉冲激发，减少荧光淬灭。

图1

图2

图1是Akoya Vectra Polaris新七色通道的激发光和发射光，同时Akoya Vectra Polaris还可适配传统荧光染料如图2。

TSA结果分析

Akoya Vectra Polaris 扫描后的荧光数据图像，可以用HALO进行进一步的分析。HALO是数字病理学定量组织分析的图像分析平台，可以分析整个组织切片（包括IHC和mIHC）中每个细胞的形态和多重表达数据，主要用于肿瘤学、毒理学、代谢学、神经科学等领域的分析。

百奥动物HALO 系统拥有的附加组件可以满足客户不同的分析需求，例如用于自动组织分割的组织分类器（Classifier）、用于将明场或荧光每个细胞蛋白表达的定量分析（Area Quantification FL、Area Quantification 、HighPlex FL、Multiplex IHC）、用于识别细胞相对空间分布的空间分析（Proximity analysis）、用于肿瘤组织的免疫浸润分析（Infiltration analysis）等。这些插件还兼容各种图像和数字幻灯片格式，即 JPG、TIF、ND2、MRXS、QPTIFF、组件 TIFF、VSI、NDPI、NDPIS、SVS、AFI、CZI、SCN、LIF 和 BIF。