【病理专题】冰冻制片技术和要点介绍及应用原创|BioMice百奥动物

在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，能够完好的保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原，因此比较适合手术中快速病理、显示组织中的脂质、显示酶活性和免疫荧光等方面的研究，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。主要有直接冰冻切片法、明胶冰冻切片法、冰冻切片粘片法及冰冻包埋液（OCT Compound）包埋切片法。

冰冻切片与石蜡切片的区别

01冰冻切片

优点

制片快速时间短

步骤简单

组织保持原有形态

抗原活性及酶的活性保存较好

缺点

组织不宜过大

不能连续切片

保存时间短

02石蜡切片

优点

细胞定位准确

可常温长期保存

细胞形态结构保存完好

可连续切片

缺点

程序步骤制片时间长

制片中抗原活性会降低，可能影响后续检测

冰冻切片使用仪器耗材介绍

使用耗材：冰冻头、包埋盒、刀片

使用试剂（HE）：冷冻包埋剂、苏木素、伊红、二甲苯、盐酸、氨水等

使用试剂（油红O）：冷冻包埋剂、苏木素、10%福尔马林、油红O试剂、无水乙醇/异丙醇等

使用仪器：冰冻切片机、染色机

冰冻切片技术和要点介绍

01取材

新鲜组织取材不能接触水、血液等液体，若组织自身带水或血液或多，可用滤纸吸干，可一定程度上防止冰晶空洞等现象的发生；

其次所用器械要保持干燥，取材时尽量避开出血坏死区域及脂肪区域；

所取组织块可根据组织大小选择包埋盒，一般不宜过大。若组织过大，切片时阻力加大，可能会产生刀痕及褶皱，加大制片的难度，影响冰片质量。

02包埋

根据组织块大小选择包埋盒后，在包埋盒底部滴加一层包埋剂，注意不能有气泡；

将组织根据不同的制片要求放入底部，随后加满包埋剂，放入液氮上方迅速冷冻，包埋剂彻底变白后取出。

如需要立刻制片，则将包埋块放入冰冻切片机中30min左右调节温度后即可切片，若不需要立即制片，则放入-80℃冰箱长期保存。

注意：冰冻的温度与时间是制作冰冻切片的关键因素，需要根据组织的种类、厚度和大小来调节；冰冻温度过低，会造成组织过硬，切片碎裂；温度过高会造成组织硬度不够，难以切片。

03切片

将冻好的组织放入冰冻切片机调节温度后，在冷冻头上滴加包埋剂，将包埋盒中的组织平行放在冷冻头上，开始切片。

切片前先进行粗修，修至组织最大面后，调整刀片进行切片。

切片时右手摇轮转要力道均匀、柔和、缓慢，切片厚度掌握在6-8μm（根据不同组织进行调节），左手持毛笔在切片形成时按住组织边缘，使其不发生卷曲。

将切片展平粘贴在干净的载玻片上，立即放入固定液中固定（一般使用丙酮固定5-10s，可根据不同需求调节固定时间和固定液），如果固定不及时，会发生细胞退变，切片中细胞核模糊不清呈雾状。

固定后可将切片放入-20℃/-80℃冰箱中保存，使用前用纯水洗去包埋剂即可。

04制片注意事项

冰冻切片的组织要尽可能新鲜，吸取水、血等液体，动作要迅速。

取材大小要厚薄适中，在确保取到主要病变的前提下，尽量避开钙化、坏死、脂肪等。

冰冻切片机的温度和厚度要根据不同组织进行调节。

切片时速度不宜过快，否则易形成冰晶，破坏组织。

05形成冰晶的原因及解决方法

超速冷冻会导致组织内的水份快速结冰，形成较大的冰晶。

解决方法：使组织受冷均匀。

冷冻速度过慢，会导致冷冻过程中逐渐形成冰晶，时间越长，冰晶越多。

解决方法：选择适当的冷冻方式如液氮。

组织自身含水量过多，会导致大量冰晶形成，破坏组织，造成切片困难。

解决方法：调整组织大小。

切片刀温度过高，会导致组织样本表面快速融化，融化后又重新冷冻会形成大量冰晶。

解决方法：刀的温度保持在-17℃—-20℃之间。

切片速度过快，刀片与组织的接触时间较短，组织无法充分冻结。这会导致切片表面出现冰晶。

解决方法：控制切片速度，匀速切片。

切片刀角度不正确会导致切割力不均匀，造成切片表面的压力不均。这可能会使组织样本变形或破裂，进而增加冰晶的形成。

解决方法：将到头调整到合适的角度，时刻观察。

冰冻切片的应用

冰冻切片快捷、简便，多应用于手术中的快速病理诊断。常见的染色多为HE染色，油红O染色及免疫组组化、免疫荧光等。

染色HE

油红O染色

小鼠结肠瑞士卷冰冻切片HE染色

小鼠肝脏冰冻切片油红O染色

（上图不染细胞核，下图染细胞核）

小鼠脾脏冰冻切片免疫荧光染色

小鼠肿瘤冰冻切片免疫组织化学染色