NK细胞作为先天性免疫细胞中的杀伤细胞，可直接杀伤病原体和肿瘤细胞。与T细胞相比， NK细胞具有更强的肿瘤识别和杀伤能力，以及更强的现货型应用的潜质。如何改造治疗性抗体药物的恒定区（Fc端）使其更好地激活先天免疫反应，增强抗体依赖的细胞毒作用（ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity），如何评估能够特异性结合CD16A的双（多）抗药效是药物研发科学家所感兴趣的问题。

CD16A靶点介绍

 人的IgG Fc受体有三大类：FcγRI（CD64），FcγRII（CD32）和FcγRIII（CD16）。其中第二类包含IIA/IIB/IIC三个亚类，第三类包含IIIA/IIIB两个亚类（图1）。与激活具有杀伤功能的先天免疫细胞（如NK细胞）最相关的受体是IIIA，也被称为CD16A。CD16A表达于NK细胞、单核细胞和巨噬细胞表面，也少量表达于DC细胞表面，属于激活型受体。

图1. 人FcγR的结构、细胞分布和与IgG亚型抗体的结合亲和力^[1]

 然而，人鼠有别。小鼠的IgG Fc受体可分为四大类，分别为FcγRI，FcγRIIB，FcγRIII和FcγRIV[2]，且细胞分布与人不同。人FcγRIIIA在鼠中的同源基因是FcγRIV[3]。鼠FcγRIV表达于单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。人源化B-hCD16A小鼠中FcγRIV基因的调节区域和全部外显子区域（1-5）替换为人的FCGR3A基因的调节区和外显子1-4区。

图2. 由抗体Fc区介导的效应功能类型^[4]

 细胞表面表达的Fc受体可直接诱导或调节细胞的活化，其效应可包含ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞杀伤作用）和CDC（补体依赖的细胞毒作用）（图2）。而以CD16A作用为靶向的抗体药物可以分为两类。一类是具有抗体恒定区（Fc）的IgG衍生抗体，以抗体Fc段结合CD16A受体的方式增强细胞的杀伤作用，通常对于治疗性抗体的Fc区改造可以增强其与CD16A的结合。

图3. Bispecific Killer cell Engager (BiKE) 作用机制^[5]

 另一类是不具有抗体恒定区，只具有可变区的双抗，如双特异性杀伤细胞衔接器（Bispecific Killer cell Engager, BiKE）（图3）和四价双抗（tandem diabody, TandAb）。它由人工构建的表达载体来生产，包含两对抗体的轻重链可变区，形成两个Fv（图3）。此类抗体发挥效应的形式主要是拉近表达肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen, TAA）的肿瘤细胞与以NK为代表的杀伤细胞之间的距离，增强杀伤。

靶向CD16A的药物进展

 由于人CD16A主要表达于NK细胞，所以靶向CD16A的药物多是通过增强NK细胞活性来实现治疗效果的。目前，一款已上市的抗体药物Margenza（Margetuximab）通过对靶向Her-2抗体Fc区的工程化改造（MacroGenetics公司专有的Fc优化平台），增强了抗体与CD16A的亲和力，并且减弱与抑制性受体CD32B的亲和力，从而增强了先天免疫系统的参与，更好地杀伤Her2阳性的肿瘤细胞。因此，Margenza也被称为优化版的赫赛汀（Herceptin, trastuzumab, 曲妥珠单抗，靶向Her2）。

 对于在研药，专注于挖掘先天免疫系统的潜力来治疗肿瘤的公司Affimed有3款靶向CD16A的产品，均为四价双抗。其中，AFM12靶向CD19/CD16A，AFM13靶向CD30/CD16A，AFM24靶向EGFR/CD16A。其设计均为一头靶向肿瘤相关抗原，一头靶向CD16A，从而拉近以NK细胞为代表的先天性免疫细胞与肿瘤细胞之间的距离，促进其对肿瘤细胞的杀伤。此外，GT Biopharma公司正在研发一款三特异性抗体GTB-3550。它的两臂分别靶向CD33和CD16A，并且还与修饰的人IL-15连接，形成一个TRiKE （Trispecific Killer Engager）结构。与上述的双抗相比，这款抗体还携带有人IL-15，能够促进NK细胞活性，有助于维持、延长和增强抗体效应。

B-hCD16A小鼠

表达分析

01 mRNA表达检测

 只有在野生型小鼠中可以检测到鼠Fcgr4 mRNA，只有在纯合人源化B-hCD16A (H/H)小鼠中才能检测到人FCGR3A mRNA。

02 蛋白表达检测

NK细胞

 只有人源化小鼠的NK细胞表达人CD16A，野生型小鼠的NK细胞不表达鼠CD16A。

巨噬细胞

 验证检测抗体恒定区不会非特异性结合CD16A后，由检测抗体特异性结合实验得出人源化小鼠和野生型小鼠的腹腔巨噬细胞均表达其所对应的CD16A。

单核细胞&粒细胞

 （A）人源化小鼠和野生型小鼠的单核细胞均表达其所对应的CD16A。

 （B）只有野生型小鼠的粒细胞表达其所对应的鼠源CD16A，而人源化小鼠的粒细胞不表达其所对应的人源CD16A。

野生鼠和B-hCD16A小鼠各免疫细胞群表达CD16A的情况统计

 人CD16A表达于NK细胞，单核细胞，DC细胞和巨噬细胞[1]。在B-hCD16A小鼠中，鼠FCGR4在原来表达的细胞中均检测不到，而人CD16A具有与人类相似的表达谱。

 人源化小鼠NK细胞hCD16A表达水平与人PBMC相似。

免疫细胞分型分析

 对野生型小鼠的CD16A人源化改造不影响各类免疫细胞的分化和组成。

 对野生型小鼠的CD16A人源化改造不影响CD4+ T细胞、CD8+ T细胞及Treg细胞的分化与组成。

肿瘤生长曲线

 小鼠结肠癌细胞MC38或靶点人源化MC38在B-hCD16A小鼠中均可成瘤。

 由此可见，百奥动物自主研发的人源化小鼠B-hCD16A有望助力靶向CD16A抗体药物的发现与评价。

参考文献

[1] Smith, K., Clatworthy, M. FcγRIIB in autoimmunity and infection: evolutionary and therapeutic implications. Nat Rev Immunol 10, 328–343 (2010). https://doi.org/10.1038/nri2762

[2] Bruhns, P. "Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models - ScienceDirect." Blood: The Journal of the American Society of Hematology (2012). https://doi.org/10.1182/blood-2012-01-380121

[3] Mancardi DA, Iannascoli B, Hoos S, England P, Daëron M, Bruhns P. FcgammaRIV is a mouse IgE receptor that resembles macrophage FcepsilonRI in humans and promotes IgE-induced lung inflammation. J Clin Invest. 2008 Nov;118(11):3738-50. doi: 10.1172/JCI36452. Epub 2008 Oct 23. PMID: 18949059; PMCID: PMC2571035.

[4] Kubota, T., Niwa, R., Satoh, M., Akinaga, S., Shitara, K. and Hanai, N. (2009), Engineered therapeutic antibodies with improved effector functions. Cancer Science, 100: 1566-1572. https://doi.org/10.1111/j.1349-7006.2009.01222.x

[5] Guy DG, Uy GL. Bispecific Antibodies for the Treatment of Acute Myeloid Leukemia. Curr Hematol Malig Rep. 2018 Dec;13(6):417-425. doi: 10.1007/s11899-018-0472-8. PMID: 30280288; PMCID: PMC6295344.