骨科Cre鼠高分助攻相关疾病研究|BioMice百奥动物

从干细胞分化为成熟的成骨细胞需要许多步骤。间充质干细胞（MSCs）和骨骼干细胞（SSCs）均可产生成骨细胞。然而，这两个干细胞群之间的关系尚未精确确定。因此，为了研究每种中间细胞类型的功能，可使用转基因小鼠来了解谱系指定过程。Cre重组酶（Cre）–loxP系统可实现条件基因的失活，从而Cre切除与目标基因相对应的“目标” DNA序列，该序列侧翼有两个称为“ loxP位点”的34bp DNA序列。百奥动物发开了B-Sp7-iCre mice、B-Prrx1-iCre mice、B-Col2a1-iCre mice、B-Dmp1-iCre mice等可用于研究成骨细胞分化过程中特定细胞类型的Cre工具鼠模型。

B-Sp7-iCre mice

模型应用

当Sp7iCre模型与不同loxP位点侧翼基因的小鼠杂交时，它是研究此基因功能的有效工具，特别是在骨发育、成骨细胞谱系和Hedgehog/Wnt信号传导的研究中。

表达

1）表达的基因

iCre，改良的Cre重组酶，噬菌体P1

2）表达部位

成骨细胞谱系，胚胎软骨膜，骨小梁，骨领

基因编辑策略

在C57BL/6 ES细胞Sp7基因外显子2和3'UTR编码序列之间放置F2A-iCre序列盒。该种属保持在C57BL/6遗传背景上。

表型分析

通过Fam20c^flox/flox小鼠（来自得克萨斯农工大学）与Osx-Cre（C57BL/6-Sp7^tm1(icre)/Bcgen）小鼠（来自百奥赛图）交配获得Fam20c^flox/flox （条件性敲除, cKO）小鼠。

图2 Fam20c影响Calpastatin/Calpain蛋白水解系统

如上图，A.Calpastatin、Calpain 1和Calpain 2在OB Fam20c^f/f和OB Fam20c^KO的表达（qPCR）。*P＜0.05、***P＜0.001。B.通过Western blot分析Calpastatin、Calpain 1和Calpain 2在Fam20c^f/f和OB Fam20c^KO的表达。GAPDH作为内部对照。C.Phos-Tag十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（P-Tag）证明Fam20c^f/f和OB Fam20c^KO中的钙蛋白酶抑制剂磷酸化水平。GAPDH作为内部对照。D.Calpain 1和Calpain 2在Fam20c^f/f和OB Fam20c^KO中的酪蛋白酶谱图。E.Fam20c^f/f和OB Fam20c^KO中Calpastatin、Calpain 1和Calpain 2的免疫荧光染色。比例尺=20μm。F.Calpastatin、Calpain 1和Calpain 2在Ctrl和cKO小鼠股骨中的基因表达。*P<0.05，**P<0.01。G.Calpastatin在4周龄的Ctrl和cKO小鼠股骨中的免疫组织化学染色。（A1）和（B1）是骨中的游离骨小梁。（A2）和（B2）是钙化软骨中的骨形成部位。（A3）和（B3）是软骨增殖区和肥大区的交界处。红框表示局部放大，比例尺=50μm。（a1）、（a2）、（a3）、（b1）、（b2）、（b3）是相应的放大区域，比例尺=20μm。H.4周龄Ctrl和cKO小鼠股骨中Calpain 1 和 Calpain 2的免疫组织化学染色。比例尺=50μm。

实验结果表明Calpain1和Calpain2基因的表达显著降低（图2F）。免疫组织化学（IHC）染色分析显示，在cKO小鼠的骨小梁表面和软骨钙化区的前成骨细胞中，Calpastatin免疫反应性较低（图2G）。对于Calpain1和Calpain2的表达，IHC染色显示免疫反应性显著降低（图2H）。^[2]

发表文章

Fam20c regulates the calpain proteolysis system through phosphorylating Calpasatatin to maintain cell homeostasis.

Distinct roles for Hedgehog and canonical Wnt signaling in specification, differentiation and maintenance of osteoblast progenitors.

B-Prrx1-iCre mice

模型应用

当Prrx1iCre模型与不同loxP位点侧翼基因的小鼠杂交时，它是研究此基因功能的有效工具，特别是在研究中胚层发育，如心脏、骨骼发育和信号传导方面。

表达

1）表达的基因

iCre，改良的Cre重组酶，噬菌体P1

2）表达部位

老鼠胚胎、心脏、骨骼和成人平滑肌组织的中胚层

基因编辑策略

在C57BL/6 ES细胞Prrx1基因外显子1和5'UTR编码序列之间放置F2A-iCre序列盒。该种属保持在C57BL/6遗传背景上。

表型分析

将Prrx1-Cre (C57BL/6-Prrx1^tm1(iCre)/Bcgen) (来自百奥赛图)小鼠与ALPL-floxed等位基因杂合的小鼠进行配对获得组织特异性Cre介导的ALPL敲除模型。

ALPL缺乏导致骨髓间充质干细胞中l型Ca²⁺通道的膜表达降低。a. Ca²⁺成像显示，转染shALP的alpl^+/−BMSCs和WT BMSCs (shALP/WT)在30 mmol·L⁻¹ KCl刺激3 min (n = 10）后，Ca²⁺内流减少。b .经10 mmol·L⁻¹ EGTA处理3 min（n = 10），培养的WT、alpl^+/−和shALP/WT BMSCs均未检测到KCl诱导的Ca²⁺内流。c. 在alpl^+/−（Lenti-alp/alpl^+/−）骨髓间充质干细胞中，ALPL过表达是由慢病毒介导的，在30 mmol·L⁻¹ KCl刺激3min（n = 10）后，导致Ca²⁺内流升高。d、e.评估Ca_V1.1、Ca_V1.2、Ca_V1.3的表达。alpl^+/−BMSCs的细胞总表达量减少(d)和Ca_V1.2、Ca_V1.3的膜表达量(e) ，细胞质Ca_V1.2和Ca_V1.3表达水平没有明显变化(e)，在alpl^+/−BMSCs中，总Ca_V1.1蛋白表达没有改变(d)，膜和细胞质Ca_V1.1的表达没有改变(e)。f.细胞表面生物素化实验。左两个通道:western blot检测WT和alpl^+/−BMSCs中中性蛋白下调后的Ca_V1.2和Ca_V1.3;右两个通道:输入，而不是生物素化细胞。h.共聚焦激光扫描显微镜代表性图像，显示WT和Lenti-alp/alpl^+/−BMSCs中Ca_V1.2和Ca_V1.3的膜位置(绿色)。用标记物CellMask™Deep Red plasma membrane Stain(红色)(h)对质膜进行染色。比尺，10 μm。^[3]

发表文章

Ionomycin ameliorates hypophosphatasia via rescuing alkaline phosphatase deficiency-mediated L-type Ca2+ channel internalization in mesenchymal stem cells.

参考文献：

[1] Salhotra A , Shah H N , Levi B ,et al.Mechanisms of bone development and repair[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2020, 21(11).DOI:10.1038/s41580-020-00279-w.

[2] Fam20cregulates the calpain proteolysis system through phosphorylating Calpasatatin to maintain cell homeostasis[J].Journal of Translational Medicine, 2023, 21(1).DOI:10.1186/s12967-023-04275-4.

[3] Jin Y , Li B , He X ,et al.Ionomycin Ameliorates Hypophosphatasia via Rescuing Alkaline Phosphatase Deficiency-mediated L-type Ca2+ Channel Internalization in Mesenchymal Stem Cells[J].Bone Research[2023-10-30].DOI:10.1101/545418.