2021年全球癌症细胞免疫治疗在研药物管线数据显示，相比2020年，各类细胞治疗药物的数量均有显著增加，其中CAR-T细胞治疗位于榜首。常用的细胞免疫疗法包括LAK、CIK和NK等非特异性免疫疗法以及TIL、CAR-T和TCR-T等特异性免疫疗法。其中，CAR-T细胞疗法由于在血液肿瘤领域的出色表现成功引起了公众关注。截止目前，FDA已批准6款CAR-T细胞免疫治疗产品用于淋巴瘤和骨髓瘤的治疗，国内也有2款CAR-T细胞治疗产品获批。

图1：2021年全球细胞免疫治疗药物管线^[1]

嵌合抗原受体（CAR）是一种细胞表面受体蛋白，它赋予了免疫细胞靶向特定抗原蛋白的能力。从结构上看CAR是由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域三个功能结构域组成。胞外结构域由负责识别并特异性结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段（scFv）及铰链区（Hinge）构成。胞内结构域由共刺激结构域和信号转导结构域构成。

图2：CAR结构介绍^[2]

鉴于CAR-T细胞疗法的飞速发展，目前也衍生出了CAR-NK、CAR-NKT、CAR-M、CAR-Treg、CAR-γδT等以CAR作为核心技术的一系列新型细胞疗法，共同引领CAR疗法成为肿瘤细胞免疫治疗的一大趋势。

CAR-T

CAR-T也叫嵌合抗原受体T细胞。从结构上看，CAR-T目前发展到了第五代：第一代 CAR-T依赖CD3ζ来介导T细胞的激活，这类CAR-T由于缺乏胞内共刺激信号，并不能提供长时间的T细胞扩增信号，因此临床疗效有限；第二代和第三代 CAR-T主要为了提高T细胞的增殖活性并进一步延长其存活时间，设计时在胞内信号转导区增加CD28、4-1BB或ICOS 等一个或两个共刺激分子；第四代CAR-T主要目的是克服肿瘤免疫微环境的抑制，引入了促炎症细胞因子（IL-12、IL-15、IL-18 等）和共刺激配体；第五代 CAR-T在第二代的基础上添加了激活其它信号通路的共刺激结构域，比如 IL2-2Rβ胞内结合 SAAT3/5的结构域等。目前，大多数公司产品主要以第二代CAR-T技术为基础，在此之上进行探索开发。

图3: 第一代到第五代CAR-T细胞结构^[2]

CAR-T细胞治疗目前在血液瘤的治疗中取得了不错的效果，有6款CAR-T细胞治疗药物获得了FDA批准。但CAR-T在实体瘤中的疗效很有限，部分原因与其回输到患者体内后会经历一种叫“耗竭（功能障碍）”的过程有关。CAR-T细胞耗竭主要体现为持续抗原刺激、CAR结构的共刺激域或抑制性受体的持续性表达等。2021年底有研究报道，CAR-T耗竭过程的关键分子机制与SOX4和1D3等抑制性分子有关，抑制这些分子的表达可以一定程度上增强CAR-T的治疗效果^[3]。此外，CAR-T细胞治疗目前也面临其他困境，如全身或者脱靶毒副作用，主要包括细胞因子释放综合症（CRS）、神经毒性和CAR-T细胞相关脑病综合症等。CAR-T治疗在实体瘤中的治疗目前还未成功，另外一个可能的原因就是肿瘤免疫微环境（TME）的抑制性，肿瘤微环境中浸润的免疫抑制性细胞如MDSCs、调节性T细胞（Tregs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）等会影响CAR-T的治疗效果。从CAR-T本身来看，其制备过程相对耗时并且费用昂贵，也成为了患者可以接受CAR-T细胞疗法的一个重大挑战。

目前对于CAR-T细胞治疗面临的一些问题也有了一定的应对策略[4]。通过在CAR结构中增加一些内在的“开关”来增强其在体内的调节, 可以进一步减轻CAR-T细胞治疗产生的全身毒性作用。例如引入一些自杀基因如单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）到CAR-T结构中，如果CAR-T细胞治疗后出现毒性，可以在转染HSV-TK的细胞中应用特性小分子，通过激活HSV-TK最终引发细胞凋亡及快速终止CAR-T细胞治疗。另外，为了缓解CAR-T细胞治疗的脱靶毒性，可对CAR-T细胞进行改造，在T细胞上同时串联或并联相同或者不同的CAR，进一步加强CAR对抗原蛋白的识别，减小脱靶的可能。此外，除了常规自体CAR-T细胞，通用型CAR-T细胞的研发也有了一定的进展，旨在改善CAR-T细胞的生产失效，降低价格，增加CAR-T细胞的临床效果等。

CAR-NK

NK细胞（自然杀伤细胞）是机体一种重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，与超敏反应和自身免疫性疾病的发生也相关。目前正在开发的NK细胞治疗产品主要包括自体或异体NK细胞治疗产品以及CAR-NK细胞产品。与CAR-T细胞相同，CAR-NK细胞结构上也分为胞外的抗原识别区和铰链区、跨膜区以及胞内共刺激域和信号转导区，并且也经历了四代CAR-NK的发展。

图4: CAR-NK细胞结构设计^[5]

相较于CAR-T疗法，CAR-NK细胞作为效应细胞具有很多优越性：

（1）更好的安全性：未修饰NK细胞及CAR-NK细胞的安全性例如没有产生如细胞因子释放综合症和神经毒性等毒副作用以及异体NK细胞不会诱发移植物抗宿主反应（GVHD），这已经在许多临床试验中得到证实。

（2）多种肿瘤杀伤机制：CAR-NK细胞除了CAR介导的靶向杀伤之外，还可以通过NK细胞自身抗肿瘤的特性，如通过另外两个共同刺激分子，即NKG2D和CD244增加其细胞毒性能力和细胞因子的释放，以及通过ADCC等作用识别并杀伤CAR靶标下调或缺失的肿瘤细胞，提高免疫治疗效果。

（3）来源更广泛：CAR-T细胞大多来源于患者自体或人类健康供体细胞，NK细胞可来源于包括外周血（PBMC）、CD34+造血祖细胞（HPC）、脐带血（UCB）、诱导多能干细胞（iPSC）、NK-92等细胞系。

（4）同种异体CAR-NK获取更方便，并且质量相对均一和高效。

目前CAR-NK细胞疗法已有很大进展，但仍局限于临床前研究，尚未有上市细胞产品。另外，NK细胞在人体内寿命短，NK细胞归巢到肿瘤部位的效率还需要进一步改进，以及肿瘤免疫微环境的抑制性会限制其临床治疗效果，这些都是CAR-NK细胞治疗目前面临的一些问题。

关于下一代CAR-NK细胞的制备，目前有研究报道主要从以下几个方面改善：

（1）可通过趋化因子受体的异位表达增强NK转运及向肿瘤部位的浸润。

（2）损伤NK细胞免疫功能负调控因子基因有助于克服功能衰竭。

（3）中和scFvs可以拦截与CRS/ICANS连接的细胞GM-CSF。

（4）使用IL-12/15/18细胞因子预处理，诱导形成具有增强效力的记忆性NK细胞。

（5）敲除细胞表面和细胞内分子，通过阻止NK细胞互相杀伤(CD38 KO)或免疫抑制(GR KO)来影响NK细胞进行联合治疗。

（6）代谢重编程旨在通过干预代谢途径使NK细胞抵抗功能衰竭机制。

（7）靶向基因消融抑制受体可以保护CAR-NK细胞免受免疫抑制肿瘤微环境的影响。

图5: 下一代CAR-NK细胞免疫疗法发展策略^[6]

CAR-M

CAR-T细胞疗法在血液瘤治疗方面效果显著，而在实体瘤中的疗效十分有限，这与实体瘤自身异质性以及微环境的抑制性有很大关系。实体瘤本身具有高度异质性，这也限制了靶向单一抗原的CAR-T细胞疗法的疗效。另外，肿瘤免疫微环境十分复杂，实体瘤通过构建具有免疫抑制特性的肿瘤微环境，可以阻止免疫细胞向病灶部位的转运，以及T淋巴细胞对肿瘤的浸润。即便有少量T淋巴细胞能够浸润到肿瘤中，微环境中的免疫抑制细胞或抑制因子也会限制T细胞的免疫杀伤反应。

CAR修饰的巨噬细胞（CAR-Macrophage，即CAR-M）被认为是一种有望突破实体瘤治疗的细胞类型。与CAR-T和CAR-NK细胞结构相似，CAR-M细胞由识别特定肿瘤抗原的胞外结构域、跨膜区域和细胞内激活信号区域组成。经过基因工程改造的CAR-M细胞不但能够靶向吞噬肿瘤细胞，还能够通过分泌促炎症细胞因子改变肿瘤附近的微环境，同时还能将肿瘤抗原提呈给T细胞，激活T细胞对肿瘤的免疫反应^[7]。

目前CAR-M细胞治疗已有一定进展。2016年，CAR-T细胞治疗专家Saar Gill和Michael Klichinsky创建了CARISMA Therapeutics公司，主要致力于开发CAR-巨噬细胞疗法（CAR-M）用于治疗肿瘤。到2020年，他们发表研究性论文报道，采用靶向HER2的CAR-M进行治疗，在小鼠模型上观察到了良好的肿瘤杀伤效果，并发现其能够将M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞，诱导炎症性肿瘤微环境，增强T细胞的抗肿瘤细胞毒性。另外，2021年9月22日，CARISMA Therapeutics宣布，美国FDA已授予细胞疗法CT-0508快速通道资格。2022年3月，CARISMA Therapeutics宣布完成CAR-M细胞疗法CT-0508（靶向HER2，针对实体瘤）的首例受试者给药，这是全球首次将CAR-M应用于临床研究中。

图6：CAR-M细胞在异种移植模型（NSG小鼠接种SKOV3细胞系CDX模型）的抗肿瘤药效，持久性和转运情况^[8]

CAR-M细胞治疗为实体瘤治疗带来了很大的希望，但该疗法也存在需要克服的问题[9]：

（1）扩增的问题：吞噬细胞分化增殖能力远低于T细胞、NK细胞等，这会严重限制其在体内的治疗效果。如果选择对患者进行反复输注，细胞来源也会严重受限。

（2）毒性问题：和CAR-T一样，细胞因子释放综合征（CRS）是较大的风险因素，巨噬细胞一旦在体内被过度激活，其分泌的IL-1、IL-6等白介素因子可能造成CRS。

（3）杀伤效力：M细胞体内抗肿瘤能力弱，需要迭代设计CAR以增强抗肿瘤活性和选择性。

目前CAR-T和CAR-NK细胞疗法在血液瘤治疗领域中都已展现出不错的成绩，特别是CAR-T细胞疗法已有多款产品上市，CAR-M疗法有望突变实体瘤的治疗。除了上述CAR疗法在不断迭代发展，CAR-NKT、CAR-Treg和CAR-γδT等CAR疗法目前也有了一定研究和进展，期望通过不断的创新和改善，CAR疗法能够为更多的癌症患者带来福音。

参考文献

[1] Upadhaya S, Yu JX, et al. Nat Rev Drug Discov. 2021 Jul;20(7):503-504.

[2] Teresa R Abreu, Nuno A Fonseca, et al. J Control Release. 2020 Mar 10;319:246-261.

[3] Charly R. Good, M. Angela Aznar, et al. Cell. 2021 Dec 9;184(25):6081-6100.e26.

[4] Mahsa Mohammadi , Maryam Akhoundi, et al. Rev Med Virol. 2022 Jul;32(4):e2325.

[5] Ying Gong, Roel G J Klein Wolterink, et al. J Hematol Oncol. 2021 May 1;14(1):73.

[6] Alexander Biederstädt, Katayoun Rezvani. International Journal of Hematology (2021) 114:554–571.

[7] Yizhao Chen, Zhiying Yu, et al. Biomedicine & Pharmacotherapy 139 (2021) 111605.

[8] Michael Klichinsky, Marco Ruella, et al. Nat Biotechnol. 2020 August;38(8): 947–953.

[9] Kevin Pan, Hizra Farrukh, et al. Pan et al. J Exp Clin Cancer Res (2022) 41:119.