免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)均为利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，通过化学反应或荧光标记物，对组织细胞内的特异性抗原进行定位、定性以及半定量检测的一类技术。IHC染色技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机结合在一起。

IHC染色技术

01、IHC染色原理

IHC分为直接法、间接法。直接法是将酶标底物直接标记在一抗上，用酶标一抗与待检组织反应，再使用底物显色剂显色；间接法是将酶标底物标记在二抗或者与二抗具有亲和力的某种分子上，再与底物显色剂反应，间接法常用的有ABC法 、SP法 、Envison法。

IHC间接法^[1]

02、IHC染色步骤

实验过程包括切片制作，脱蜡，水化，抗原修复，非特定位点封闭，一抗孵育，二抗孵育，DAB显色，复染苏木素，封片。

03、IHC染色的质控

IHC项目切片由阳性对照片、阴性对照片及检测样本构成。阳性对照片为已知检测靶点阳性的组织，用于质控IHC染色体系无误。阴性对照片包括一抗阴性片及组织阴性片，一抗阴性片为检测样本但不进行一抗孵育（PBS孵育），用于排除二抗体系背景色。组织阴性片为已知无检测靶点的组织，用于排除一抗背景色。

一抗的选择注意点

01、选择可与检测样本种属反应的抗体

因为抗体在不同种属间存在差异，所以必须选择能与检测样本种属反应的抗体。当检测人源化小鼠被人源化改造的靶点或PDX模型肿瘤组织时，虽然检测样本的来源是小鼠，但需要使用可以与人反应的抗体。若找不到可与检测样本种属反应的抗体，可以根据物种之间序列相似性预测交叉反应性。

图片来源：abcam官网

02、选择单克隆抗体或多克隆抗体

一般单克隆抗体特异性强，产生的背景信号更少，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对低。而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，因为不依赖单一表位，因此其对微小抗原变化的包容性更强，灵敏度高，但易出现非特异性染色。

图片来源：abcam官网

03、查看一抗宿主来源

产生一抗的宿主应尽可能和检测样本的宿主种类不同，以避免二抗与样品中内在的免疫球蛋白发生潜在的交叉反应。例如检测小鼠组织样本，应避免使用宿主来源为小鼠的一抗。

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04、查看抗体是否能用于IHC

由于识别的位点不同，决定了抗体不同的使用用途。例如，部分抗体识别位点位于折叠蛋白内部，只能识别降解或变性蛋白，通常只能应用于western blotting检测。部分抗体能够识别自然折叠状态上的表位，可应用于IHC、IF等检测。需要注意：有的抗体不能结合福尔马林固定和石蜡包埋组织中的目标抗原，只能用于未固定的冰冻组织的检测。

图片来源：abcam官网

05、查看免疫原序列

刺激宿主动物产生抗体的抗原物质种类繁多，包括全长的蛋白、蛋白片段、多肽、整个生物机体（例如细菌）或细胞。免疫原通常在说明书中会有显示（但有一些情况抗原是专利资料，不能公开）。如果要检测的是一个蛋白片段或全长蛋白的异构体或特定区域，应该选择由该特异片段或区域或者包含该特异片段或区域所制备的抗体。

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06、靶点及抗体信息查询网站

• 靶点信息：https://www.genecards.org/
• 蛋白/序列信息：https://www.uniprot.org/
• 蛋白表达信息：https://www.proteinatlas.org/
• 抗体信息查询：https://www.biocompare.com/Antibodies/
• 同源性信息查询：http://asia.ensembl.org/index.html

07、案例：人源化鼠的鉴定

检测需求：检测IGF1R人源化小鼠是否改造成功，并可原位检测到hIGF1R。

背景：胞外区域人源化（The chimeric CDS that encodes human extracellular domain and mouse intracellular domain was inserted into exon 2 of mouse Igf1r gene in B-hIGF1R mice. ）

检测样本：野生型小鼠及IGF1R人源化小鼠脑组织

一抗的选择：

1、只与人胞外域反应的anti-hIGF1R  

2、与鼠反应的anti-mCD31（用于共定位）

预期结果：

1、野生型小鼠为mCD31+hIGF1R-的检测结果。

2、hIGF1R小鼠为mCD31+hIGF1R+的检测结果。

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参考资料：

[1]《免疫组织化学病理诊断》第二版，吴秉栓、刘彦仿著。