精子冷冻是基因改造小鼠资源保存的关键技术之一，可放置在液氮中长期保存。与胚胎冷冻保存相比，精子的冷冻保存需要较少的供体小鼠，方法也更加便捷简便。精子复苏则相对复杂，需通过体外受精（IVF）和胚胎移植进行小鼠品系的重建。

今天我们就来介绍下小鼠精子冷冻以及精子复苏的技术操作。

精子冷冻简介

1、精子冷冻的原理

小鼠精子冷冻是通过低温处理的方式，使精子的新陈代谢活动被降低或抑制，从而延长其保存寿命。

将雄鼠处死，采集附睾尾中的精液，经过初步处理后混入冷冻保护剂中，装入麦管。以一定的速率降温。到特定温度使精子细胞的代谢作用暂时停止或减弱到足够小的程度，并在此温度下长期保存。

2、精子冷冻的注意事项

精子细胞内是有水分的，冷冻保存过程中随着温度的降低，水会结成冰晶，而冰晶会导致精子内渗透压的改变以及刺伤膜结构，对精子造成致死性损伤。精子冷冻保存的关键是防止在降温或者解冻的过程中大量冰晶的形成。因此冷冻的关键在于选择合适的冷冻保护剂。

冷冻保护剂分为渗透性性和非渗透性两大类。渗透性保护剂包括甘油、二甲基亚砜（DMSO）、丙二醇和乙二醇等，这些物质可穿过细胞质膜，替换精子细胞中的水，达到冷冻保护的作用。但很多研究表面，这类保护剂在较高的浓度下对细胞有毒害作用，对精子造成渗透损伤，使精子的受精能力显著降低；但是非渗透性保护剂，例如棉子糖、蔗糖、白蛋白，聚乙二醇和聚乙烯吡咯酮等，这类保护剂不能穿过质膜，但是在精子细胞周围提供了高渗透压环境，在冷冻过程中也能提供很好的保护作用。

3、精子冷冻的精子选择

哪些雄鼠能有幸被选择被冻存精子，将优良基因保存下来呢？当然选年富力强的帅哥了。

8周龄以上性成熟雄鼠（最好3~5月龄），生长发育良好、生殖器发育正常、眼睛有神、反应敏捷、体质强壮、被毛完整有光泽、生育力好。在冷冻前进行过成功交配，而在近2~3天内未进行交配的雄鼠。

精子冷冻操作

1、制作冻存液滴

在培养皿中央先制作一个60μL的冻存液滴，用石蜡油半覆盖液滴；再次加入60μL的冻存液，最后用石蜡油完全覆盖液滴，获得一个底面积小但体积足够大的冻存液滴。放在热台上备用。

2、制备精子悬浊液

雄鼠颈椎脱臼安乐死，开腹取出左右两侧的附睾尾放在滤纸上，剥离附睾尾上的脂肪和血液。放在M2操作滴液里小心地清洗附睾尾。将两侧附睾尾放进冻存液微滴中，剪刀在附睾尾处剪开5~6切痕，轻轻挤压附睾加速释放精子。

3、精子填充进麦管

取洁净空皿置于37℃恒温热台上，用10μL移液枪吸取精子悬浊液滴10μL，可吸取出10个小微滴，第10个微滴可加入到精子获能液滴中，放培养箱10min后观察液滴边缘的精子运动，初步判断该批次冻存精子的品质（活精数量，精子活动速率）。

将麦管棉塞端插入对应的1mL注射器，依次吸入装管液、空气，吸精子悬液，继续吸至装管液浸润棉塞，用麦管封口器将麦管靠精子端密封。

4、液氮冷冻保存

麦管在液氮蒸汽上预冷10min后，立即下沉完全没入液氮进行长期保存。

精子复苏操作

如果需要复活小鼠了，我们应该怎么办呢？下边一起来看看我们如何将冻存的小鼠精子复苏，成功孕育成小鼠的吧。

1、准备体外受精(IVF)所需的雌鼠

提前超排供体雌鼠，剪下输卵管，剥离出卵团，放入受精液微滴中备用。

2、复苏冻存精子

将精子麦管从液氮中找出，加入到37℃水浴锅中加热10min。10min后取出麦管，剪断棉塞端，插入注射器，将精子悬浊液推入精子获能液微滴中，培养箱培养30min，完成获能。

3、加精、体外受精

吸取有活力的精子加到提前备有卵子的受精液微滴中，皿放入培养箱至发育到受精卵或2cell。

4、移植、饲养孕鼠

提前准备好假孕鼠，将受精卵亦或是2cell移植到假孕鼠输卵管中，饲养有孕雌鼠，19天后小仔出生。

参考资料：

[1] 图片来源：网站小鼠生殖工程学技术 (jinpanbio.com)

[2]《小鼠胚胎操作实验手册》（原著第三版）