基因工程小鼠是以分子遗传学为理论基础，通过遗传改造技术对小鼠基因组进行有目的地改造或修饰，以获得新的功能或表型，用于研究基因的功能、调控机理以及相互作用等基因的内在信息。除此之外，可以通过修饰某些基因而提高抗原的免疫反应，通过遗传改造诱导制备疾病模型，也可以解决药物安全性评价、药效评价、机制研究等问题。目前，基因工程小鼠已被广泛应用于各个行业，炙手可热。

基因工程小鼠大致分为转基因小鼠（Tg）、全身性敲除小鼠（KO）、条件性敲除小鼠（cKO）、敲进小鼠（KI）、点突变小鼠（mKI）这5大类。常用到的基因编辑技术包括：基于小鼠胚胎干细胞的ESC/HR技术、基于靶向核酸酶的CRISPR/Cas9技术以及转基因技术。由于CRISPR/Cas9技术具有精确、高效、便捷、周期短、不受物种限制等优点，使其被广泛应用。那么，通过CRISPR/Cas9技术制备的基因工程小鼠该如何进行基因型鉴定呢？基因工程小鼠的改造是否成功，基因型是否符合预期结果，通常采用PCR技术、Southern Blot技术以及测序技术综合进行判断。

PCR技术及原理

PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其最大特点是能将微量的DNA大幅增加。基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。由变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成（图1）。

图1  PCR扩增原理^[1]

01、PCR引物设计位置及鉴定过程

对于PCR扩增出的条带大小、条带数量，我们需要根据打靶方案提前确定，不同类型的基因工程小鼠，有不同的基因型鉴定策略。基于常规的KI和cKO打靶策略，简单介绍一下PCR引物设计位置及鉴定过程。

对于制备阶段得到的F0代小鼠，通常需要使用短片段、长片段PCR及长片段测序三个过程进行确认外源基因是否存在。短片段PCR, 操作简易、成功率高，用于实验的初步筛选。验证基因组中是否存在打靶载体序列，但无法区分正确重组与随机插入。长片段PCR,鉴定敲进片段是否在正确位置重组。

KI方案短片段引物设计位置示意图如下:

说明：红色箭头代表引物设计的位置及方向

引物Mut-F设计在外源基因序列中，WT-R设计在野生基因序列中，只能扩增出突变型等位基因的产物。

引物对WT-F/WT-R设计在野生基因序列中，主要用于鉴定野生型等位基因的存在，并结合Mut-F/WT-R的PCR结果判断动物的具体基因型：纯合/杂合/野生型。

短片段鉴定正确的F0代动物，会继续进行长片段PCR的确认。

KI方案长片段引物设计位置示意图如下:

L-GT-F/L-GT-R分设计在左侧同源臂的外侧和外源序列中，初步用于鉴定左侧同源臂重组位置的正确性，同理，R-GT-F/R-GT-R初步用于鉴定右侧同源臂重组位置的正确性。如果两对引物鉴定结果均正确，则PCR产物会送测序进一步确认外源序列及重组交界处碱基的正确性。

接下来介绍一下cKO方案短、长片段引物设计位置及鉴定过程。

cKO方案短片段引物设计位置示意图如下:

5’loxP-F/5’loxP-R、3’loxP-F/3’loxP-R用于确认5’、3’端loxP位点是否已整合进基因组中，引物分别设计在两个loxP位点的两侧；对于杂合动物，PCR扩增时会得到野生型和突变型等位基因的PCR产物。所以使用这两对引物能够区分动物的基因型：纯合子/杂合子/野生型。

短片段鉴定正确的F0代动物，会继续进行长片段PCR的确认。

cKO方案长片段引物设计位置示意图如下:

L-GT-F/cKO-3’-DO-R分设计在左侧同源臂的外侧和外源序列中，初步用于鉴定左侧同源臂重组位置的正确性及两正确重组的loxP是否位于同一条染色体，同理，cKO-5’-DO-F/R-GT-R初步用于鉴定右侧同源臂重组位置的正确性及两正确重组的loxP是否位于同一条染色体。如果两对引物鉴定结果均正确，则PCR产物会送测序进一步确认外源序列loxP及重组交界处碱基的正确性。

经过打靶得到的F0代动物，处于嵌合状态，为了得到稳定遗传的动物需要进一步扩繁得到F1代杂合子。F1代动物同样需要经过短片段和长片段PCR检测，除此之外，还需要进行Southern Blot检测。Southern Blot可以有效避免PCR扩增过程中的污染问题，是基因型鉴定的金标准，可以更有效地检测到正确重组和随机插入。

02、PCR鉴定过程常见问题及解决策略

PCR基因型鉴定过程中经常会遇见哪些问题？你知道对应的解决策略是什么吗？ 表1总结了PCR基因型鉴定过程中常见问题及解决策略，赶快收藏起来吧。

表1、PCR基因型鉴定过程中常见问题及解决策略

Southern Blot技术及原理

Southern Blot是最早出现的blot（印迹）技术，它是检测DNA的一种方法。具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链，此杂交过程是高度特异的（图2）。

图2 Southern Blot 原理^[2]

01、Southern Blot探针设计策略

通常采用两种探针(外源和内源)进行检测。外源探针设计在同源臂外侧，可以检测正确重组，内源探针设计在外源序列上，既可以检测正确重组又可以检测随机插入，检测的片段尽量包含外源序列。

设计位置示意图如下:

02、Southern Blot常见问题及解决策略

Southern Blot 实验过程中经常遇到的问题及解决策略是什么呢？快来表2寻找答案吧。

表2、Southern Blot 实验过程中常见问题及解决策略

经过PCR鉴定、Southern鉴定及测序确认后的基因工程小鼠，利用其作为亲本繁殖得到的子代鼠再次进行鉴定时，只需进行小片段PCR或小片段PCR结合测序鉴定即可。

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参考资料

[1] https://baijiahao.baidu.com/s?id=1641780288609677682&wfr=spider&for=pc

[2] https://www.bilibili.com/read/cv14849803